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慢病毒包装

一、技术简介

慢病毒包装是慢病毒(Lentivirus)载体的构建过程重要的一环。慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1(H IV-1)来源的一种病毒载体,慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下,经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒,通过感染细胞或活体组织,实现外源基因在细胞或活体组织中表达。

慢病毒属于逆转录病毒科,但其基因组结构复杂,除 gag、pol和env这3个和单纯逆转录病毒相似的结构基因外,还包括4个辅助基因,vif、vpr、nef、vpu和2个调节基因tat和rev。HIV 21 是慢病毒中最具特征性的病毒,第一个慢病毒载体系统即以此病毒为基础进行构建的。慢病毒载体的构建原理就是将HIV 21基因组中的顺式作用元件(如包装信号、长末端重复序列)和编码反式作用蛋白的序列进行分离。载体系统包括包装成分和载体成分:包装成分由HIV 21基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建,能反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白;载体成分与包装成分互补,含有包装、逆转录和整合所需的HIV 21顺式作用序列。同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。为降低两种成分同源重组产生有复制能力的病毒(RCV)的可能性,将包装成分的5′LTR换成巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子,3′LTR换成 SV 40 polyA 位点等。将包装成分分别构建在两个质粒上,即一个表达gag和pol、另一个表达env。

二、实验流程

1. 根据目的基因相关信息(序列,序列号等),构建含有外源基因的重组载体。

2. 对于测序正确的重组质粒,提取和纯化高质量的不含内毒素的重组质粒。

3. 使用高效重组载体和病毒包装质粒共转染293T细胞,进行病毒包装和生产,收集病毒液。

4. 浓缩、纯化病毒液。

5. 用高质量的病毒液感染细胞。

6. 通过定量PCR精确测定病毒滴度(高精确滴定方法)和Western分析实验结果。

7. 用高质量的病毒液感染宿主细胞;检测基因功能或者siRNA的沉默效率以及使用药物进行稳定转染细胞株的筛选,通常状况下,筛选的细胞克隆株具有长期的表达稳定性。病毒液足够用于一般的动物活体实验。

三、服务说明及结果

1. 客户提供:提供基因名称,插入片段序列、NCBI登录号等信息。

2. 公司提供:病毒液(≥1×108 TU/mL),提供实验过程中所用的耗材、仪器设备和操作过程的说明清单一份。

3. 试验周期:30-40个工作日。

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